Protirakovinný efekt ionizované zásadité vody

Protirakovinný efekt ionizované zásadité vody

U myší C56BL/6, jenž byly podkožně nebo intraperitoneálně naočkovány B16 melanomovými buňkami, se při používání ionizovaná zásaditá voda projevilo výrazné zpoždění růstu nádoru a míra přežití byla významně prodloužena. Při aplikaci buněk do ocasní žíly se snížil počet B16 melanomových kolonií, a tak se i utlumil výskyt metastáz. Při užívání ionizované zásaditá vody se také výrazně snížil počet volných kyslíkových radikálů (reactive oxygen species = ROS) s výjimkou sleziny, což je hlavní orgán imunity. I u normálních myší ovlivňovala ionizovaná zásaditá voda systémové cytokiny, jako např. Th1 (IFN-?, IL-12) and Th2 (IL-4, IL-5), což ukazuje na významný imuno-modulační efekt. Jak efekt odklízení ROS, tak imuno-modulační efekt mohou být zdrojem protirakovinného efektu ionizované zásadité vody.

Úvod

 Reactive oxygen species (ROS) neboli volné kyslíkové radikály jsou jedním z hlavních zdrojů oxidačního poškození biologických makromolekul. Tyto nestabilní molekuly mohou způsobovat či zhoršovat řadu neléčitelných onemocnění jako například rakovinu, kardiovaskulární či neurodegenerativní nemoci, stejně jako stárnutí. 1,2)

Buněčné vychytávače (radical scavengers) jako například superoxiddismutáza (SOD), kataláza, glutathion peroxidáza, jsou přírodní obranné systémy proti volným radikálům. Vnější zdroje antioxidační ochrany zahrnují antioxidační vitamíny C a E, karoten a karotenoidy, stejně jako minerály jako selen a zinek. Hledání bezpečných a účinných antioxidantů bylo a zůstává předmětem intenzivního výzkumu.

Lidské tělo obsahuje 70% vody. Po napití se voda dostane do každého místa těla během 30 minut. Dokonce i hematoencefalická bariéra pro ni není žádnou překážkou. Nemá také téměř žádné vedlejší účinky. Pokud by voda sama o sobě mohla fungovat jako lapač volných radikálů, byl by to ideální antioxidant 3).

V nedávné době bylo prokázáno, že elektrolyticky redukovaná voda s vysokým pH a významným negativně redukčním potenciálem má obdobný efekt jako super oxid dismutáza a kataláza, a chrání DNA proti poškození kyslíkovými radikály in vitro. 4).

Vyvinuli jsme minerální směs pro výrobu ionizované zásadité vody s vysokým pH a nízkým ORP, stejně jako elektrolyticky vyráběná voda. Minerální směs se snadněji přenáší a je méně nákladná než
systém k produkci elektrolyzované vody . Tento článek ukazuje protinádorový účinek
zásadité vody na zvířecím modelu.

Materiály a metody

Ionizovaná zásaditá voda

Ionizovaná zásaditá voda byla vyrobena vložením směsi minerálů do lahve vody. Hodnota pH vody se zvýšila až na 10,5 a oxidačně redukční potenciál (ORP) se snížil na -200mv. Obsah minerálů byl zvyšován úměrně s časem.

 Zvířata a buňky

 Myši C57BL/6 (4-5 týdnů staré) byly získány od Daehan Bio Link Co., Ltd. (Chungbuk Korea) a živeny standardní stravou a kohoutkovou vodou, než jim byla podána ionizovaná zásaditá voda. Myší B16 melanomové buňky byly udržovány v Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) doplněné 5% na teplo citlivým plodovým hovězím sérem (fetal bovine serum = FBS) ve zvlhčené atmosféře v poměru 95% vzduch 5% CO2 při 37°C. Vysoce metastazující skupina buněk B16 byla izolována z plíce C57BL/6 myši, která byla intraperitoneálně naočkována B16 buňkami. Buňky byly klonovány pomocí metody mezního ředění a vybrané klony byly poté naočkovány do myší. Tato metoda byla opakována třikrát a konečný klon s vysokým metastazujícím potenciálem byl označen jako B16-BL6 melanomové buňky.

 In vivo vyhodnocení protimetastatického účinku

 Kultivované B16-BL6 melanomové buňky byly nashromážděny pomocí 2mM EDTA v PHS a poté třikrát propláchnuty v FBS. Celkem 1 × 106 B16-BL6 melanomových buněk bylo nitrožilně zavedeno do ocasní žíly myší C57BL/6, které byly napájeny ionizovanou zásaditou vodou. Po 20 dnech byly myši usmrceny a následně jim byly vyňaty plíce pro spočítání kolonií metastazovaných B16-BL6 melanomových buněk.

 In vivo potlačení růstu nádoru

 Kultivované B16-BL6 melanomové buňky byly nashromážděny pomocí 2mM EDTA v FBS a poté třikrát propláchnuty v FBS. Celkem 1 × 106 B16-BL6 melanomových buněk bylo podkožně zavedeno do oblasti zad myší C57BL/6. Délka dlouhé a krátké osy nádoru byla denně měřena a výsledky byly spočítány za použití vzorce ab2/2, kde a je délka dlouhé osy a b je délka krátké osy. Křivka přežití byla vykreslena za použití Kaplan-Meier metody.

 Měření hladiny cytokinů pomocí metody ELISA

 Koncentrace cytokinů v myším séru byla měřena pomocí standardní metody ELISA. Protilátky byly zakoupeny od firmy Pharmingen (USA): klony JES5-2A5 a JES5-16E3 pro IL-4; a klony R4-6A2 a XMG1-2 pro IL5. 96-jamková mikrodestička byla potažena 250 g protilátky a postupně byly přidány vzorky séra, biotinylovaná specifická protilátka, sekundární protilátka se streptavidinem a HRP a po promytí roztok o-phenylendiaminu. Enzymatická reakce byla zastavena 2N kyselinou sírovou. Absorbance byla měřena ELISA readrem při 490 nm.

 Stanovení volných kyslíkových radikálů (ROS)

 Množství cytosolických ROS bylo měřeno pomocí oxidační metody 2’,7’-dichlorofluroscein diacetate (DCF-DA)5). 12,5 M DCFDA bylo inkubováno v homogenátu jater, sleziny, plic nebo mozku a změna fluorescence byla měřena při excitační vlnové délce 485 nm a emisní vlnové délce 585 nm. Relativní fluorescenční jednotka (RFJ) byla vypočtena na 1 mg proteinu v homogenátu.

 Výsledky

 

Efekt ionizovaná zásaditá voda na růst nádoru a dobu přežití

 Růst nádoru byl významně omezen u skupiny užívající ionizovanou zásaditou vodu. Po 10 dnech od podkožního zavedení B16 melanomových buněk do boku myší C57BL/6 byla hmota nádoru viditelná a následně pravidelně měřena. K desátému dni byla velikost nádoru pro skupinu užívající ionizovanou zásaditou vodu 0,27 cm3, zatímco pro skupinu užívající kohoutkovou vodu to bylo 0,48 cm3. K devatenáctému dni byla velikost nádoru pro skupinu užívající ionizovanou zásaditou voda 3,32 cm3, zatímco pro skupinu užívající kohoutkovou vodu to bylo 6,02 cm3, což prokazuje 54% útlum.

Dále byla po intraperitoneálním zavedení B16 melanomových buněk do C57BL/6 myší monitorována míra přežití. Ionizovaná zásaditá voda prodloužila průměrný čas přežití z 36 na 44 dnů.

 Vyhodnocení protimetastatické aktivity ionizované zásadité voda na B16 metastázy na plicích

 Po nitrožilním zavedení B16 melanomových buněk do ocasní žíly C57BL/6 myší byl monitorován protimetastatický účinek ionizované zásadité vody. Po 15. dnech od zavedení byly myši usmrceny. Poté byly vyňaty plicní tkáně a porovnány metastazující léze. Skupina užívající ionizovanou zásaditou vodu měla méně metastazujících lézí. U skupiny užívající ionizovanou zásaditou voda bylo nalezeno 145 černých kolonií a u skupiny bez ionizovaná zásaditá voda 257, což indikuje 44% útlum.

Dále byla měřena koncentrace ROS pro každý orgán u myší infikovaných B16 melanomovými buňkami za použití DCFH-DA, jelikož melanomové buňky často vykazují zvýšený oxidační stres, což by mohlo urychlit vývoj metastáz. Množství ROS v plicích, játrech a ledvinách bylo velmi malé u myší užívajících ionizovanou zásaditou vodu na rozdíl od myší požívajících kohoutkovou vodu. Nicméně, slezina jakožto hlavní orgán pro imunitu, vykazovala velmi vysoké množství ROS u myší užívající ionizovanou zásaditou vodu, což ukazuje podpůrný účinek ionizované zásadité vody na imunitu.

 Vyhodnocení imuno-modulačního efektu ionizované zásadité vody

 Užívání ionizované zásadité vody zvýšilo systémové cytokiny, jako např. Th1 (IFN – gama, IL-12), cytokiny pro buněčnou imunitu a Th2 (IL-4, IL-5), cytokiny pro humorální imunitu. Takové výsledky dokazují, že ionizovaná zásaditá voda stimuluje jak buněčnou, tak humorální imunitu. Th1 a Th2 dosáhly maximálních výsledků po 2 týdnech užívání ionizované zásadité vody a poté se vrátily zpět na počáteční hodnotu. Hladina cytokinů u myší napájených kohoutkovou vodou zůstala na počátečních hodnotách.

 Diskuze

 V nedávné době bylo prokázáno, že elektrolyticky redukovaná voda s vysokým pH a významným negativně redukčním potenciálem má obdobný efekt jako super oxid dismutáza a kataláza, a chrání DNA proti poškození kyslíkovými radikály in vitro. Pokud ionizovaná zásaditá voda skutečně funguje jako antioxidant a chrání DNA proti poškození, lze se domnívat, že užívání ionizované zásadité vody by mohlo mít protirakovinné účinky.

Tento výzkum takovýto protirakovinný efekt ionizovaná zásaditá voda prokazuje. Užívání ionizované zásadité vody zpomalilo růst nádoru a utlumilo nitrožilní metastázy, což vedlo k prodloužení délky přežití u myší infikovaných B16 melanomem. B16 melanomové buňky jsou jedny z nejčastějších nádorových buněk u lidí a jsou známé pro svou vysokou schopnost invaze a metastáz6,7). Jsou schopné vyhnout se imunitnímu dozoru a šířit se rychleji než jakýkoli jiný nádor za použití mechanismů jako například útlumu MHC prezentace antigenů či zvyšování hladiny ROS, a tak dochází k urychlení vývoje metastáz. Naše studie dokázala, že ionizovaná zásaditá voda funguje nejen jako antioxidant, ale i jako silný imuno-modulátor, což by oboje mohlo být zdrojem protirakovinného účinku. Proto by ionizovaná zásaditá voda mohla být účinná jak proti různým nemocem plynoucím z nízké imunity a/nebo z vysoké hladiny ROS, tak jako prevence rakoviny8).

Ionizovaná zásaditá voda má nejen vysoké pH a nízké ORP, ale také obsahuje ionty magnezia. V nedávné době bylo prokázáno, že magnezium působí jako prevence různých nemocí8). Nelze tedy vyloučit, že protirakovinný účinek ionizovaná zásaditá voda plyne právě z výskytu magnezia.

Voda se dostane do všech tkání lidského organismu 30 minut po vypití. Bez překážek se dostává i skrz krevně mozkovou bariéru do mozku a nemá téměř žádné vedlejší účinky. Užívání ionizované zásadité voda by mohla být ideální cestou k udržení zdraví.

Převzato z Journal of International Society of Life Information Science, Japan, 2004

Převzato z http://www.ionaqua.cz

Podobné články